四元低壓液相色譜儀是指在低壓端通過比例閥將四種溶劑按比例混合后再由高壓泵輸送的液相色譜系統(tǒng)。與二元高壓系統(tǒng)相比，四元低壓系統(tǒng)可以靈活地使用四種溶劑進(jìn)行流動(dòng)相配制，在方法開發(fā)和梯度洗脫方面具有更大的靈活性。以下介紹四元低壓液相色譜儀梯度洗脫的設(shè)置思路。 了解四元低壓系統(tǒng)的特點(diǎn)
四元低壓系統(tǒng)的混合發(fā)生在泵前的低壓側(cè)，通過比例閥的開關(guān)時(shí)間來控制各溶劑的比例。混合后的流動(dòng)相再由高壓泵加壓輸送到色譜柱。這種結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是可以使用多達(dá)四種溶劑，適合復(fù)雜樣品的方法開發(fā)；缺點(diǎn)是低壓混合可能產(chǎn)生氣泡，需要在線脫氣機(jī)配合使用，且混合精度受比例閥性能影響。
在進(jìn)行梯度洗脫設(shè)置前，應(yīng)確認(rèn)在線脫氣機(jī)工作正常，四種溶劑通道都已連接好對(duì)應(yīng)的溶劑，并進(jìn)行了充分的排氣和沖洗。
溶劑選擇與通道分配
四元系統(tǒng)通常有A、B、C、D四個(gè)通道。在反相色譜中，常見的通道分配方式是：A通道為水相（如水或緩沖鹽溶液），B通道為強(qiáng)洗脫有機(jī)溶劑（如乙腈或甲醇），C和D通道可根據(jù)需要配置其他溶劑，如另一種有機(jī)溶劑、不同pH的緩沖液或改性劑。
在設(shè)置梯度前，應(yīng)根據(jù)分析物的性質(zhì)選擇合適的溶劑體系。對(duì)于大多數(shù)小分子化合物，乙腈-水體系是常用的選擇；對(duì)于芳香族化合物或需要不同選擇性的情況，甲醇-水體系可能提供不同的分離效果；四元系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于可以同時(shí)使用乙腈和甲醇，通過調(diào)節(jié)兩者的比例來優(yōu)化選擇性。
初始條件的確定
梯度洗脫的初始條件應(yīng)使分析物在色譜柱柱頭得到富集。一般來說，初始流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例應(yīng)足夠低，使大部分分析物在柱頭保留，而不隨死體積流出。對(duì)于反相色譜，可以從5%至10%的有機(jī)溶劑比例開始，根據(jù)分析物的疏水性調(diào)整。疏水性強(qiáng)的化合物可以用更高的初始有機(jī)相比例，疏水性弱的化合物則需要更低的初始有機(jī)相。
初始有機(jī)相比例也不宜過低，否則強(qiáng)保留物質(zhì)可能在柱頭過度富集，導(dǎo)致峰展寬或后續(xù)洗脫困難。
梯度斜率的設(shè)計(jì)
梯度斜率是指單位時(shí)間內(nèi)有機(jī)溶劑比例的變化率，是梯度洗脫方法中的核心參數(shù)。斜率的選擇應(yīng)兼顧分離度和分析時(shí)間。
對(duì)于成分復(fù)雜、保留性質(zhì)差異大的樣品，應(yīng)采用較緩的梯度斜率，使不同保留性質(zhì)的組分都能得到充分分離。對(duì)于成分簡(jiǎn)單或保留性質(zhì)相近的樣品，可以采用較陡的斜率，以縮短分析時(shí)間。
實(shí)際設(shè)置中，可以先設(shè)置一個(gè)較寬的梯度范圍（如從5%到95%有機(jī)相，在30分鐘內(nèi)完成）進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察所有組分的出峰情況和分布。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將梯度范圍縮小到實(shí)際出峰的區(qū)間，并調(diào)整斜率。例如，如果所有組分都在20%至60%有機(jī)相之間出峰，可以將梯度設(shè)置為從20%到60%，并根據(jù)分離度調(diào)整時(shí)間。
多段梯度的應(yīng)用
四元低壓系統(tǒng)支持設(shè)置多段梯度，每一段可以有不同的斜率和終點(diǎn)。多段梯度適合處理保留性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。
常見的多段梯度設(shè)置思路是：第一段為初始等度或緩梯度，使弱保留組分分離；第二段為較陡的梯度，快速洗脫出中等保留的組分；第三段為高有機(jī)相等度或緩梯度，洗脫強(qiáng)保留組分；最后一段為柱平衡，回到初始條件。
在設(shè)置多段梯度時(shí)，應(yīng)注意每段之間的過渡要平滑，避免有機(jī)溶劑比例突變導(dǎo)致基線波動(dòng)或壓力沖擊。四元低壓系統(tǒng)通過比例閥可以實(shí)現(xiàn)平滑的梯度過渡。
四通道的靈活運(yùn)用
四元系統(tǒng)的C和D通道可以用于實(shí)現(xiàn)一些二元系統(tǒng)難以完成的梯度。例如：
同時(shí)改變兩種有機(jī)溶劑的比例：在梯度過程中，逐漸增加乙腈的比例同時(shí)減少甲醇的比例，利用兩種溶劑的不同選擇性來優(yōu)化分離。
pH梯度：將不同pH的緩沖液分別接入不同通道，在梯度過程中改變緩沖液的pH，用于分離對(duì)pH敏感的化合物（如酸堿類化合物）。
添加劑濃度梯度：將含有不同濃度添加劑（如離子對(duì)試劑、手性選擇劑）的流動(dòng)相接入不同通道，在梯度中改變添加劑濃度。
需要注意的是，使用多通道進(jìn)行復(fù)雜梯度時(shí)，混合的均勻性和延遲體積會(huì)對(duì)分離產(chǎn)生影響，應(yīng)充分考慮系統(tǒng)的梯度滯后體積，并在方法中注明。
梯度滯后體積的補(bǔ)償
低壓混合系統(tǒng)的梯度滯后體積通常比高壓混合系統(tǒng)大，因?yàn)榛旌习l(fā)生在泵前，混合后的流動(dòng)相需要經(jīng)過泵、管路、進(jìn)樣器才能到達(dá)色譜柱。梯度滯后體積會(huì)導(dǎo)致實(shí)際到達(dá)色譜柱的梯度比設(shè)定值延遲一段時(shí)間，在不同儀器之間轉(zhuǎn)移方法時(shí)需要注意補(bǔ)償。
可以通過測(cè)定梯度滯后體積來了解系統(tǒng)的延遲情況，方法是在流動(dòng)相中加入紫外吸收物質(zhì)，測(cè)定從梯度開始到檢測(cè)器響應(yīng)變化的時(shí)間差，乘以流速即為滯后體積。在方法轉(zhuǎn)移時(shí)，根據(jù)滯后體積的差異調(diào)整梯度起始時(shí)間或延遲時(shí)間。
方法驗(yàn)證與記錄
梯度方法確定后，應(yīng)進(jìn)行必要的驗(yàn)證，包括分離度、重復(fù)性、殘留等指標(biāo)。記錄完整的梯度程序，包括各通道的溶劑組成、初始比例、各段梯度的時(shí)間和比例、流速、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)等參數(shù)，以便方法的重現(xiàn)和轉(zhuǎn)移。
